Существует 5 основных методов микробиологических исследований это:

1) микроскопический или бактериоскопический осуществляется с помощью различных видов микроскопии;

2) культуральный или бактериологический при этом методе выделяют чистую культуру бактерий и производят идентификацию их;

3) биологический, экспериментальный или биопроба с целью воспроизведения у лабораторных животных инфекционного заболевания их заражают исследуемым материалом;

4) иммунологический метод это совокупность методов основой, которых является использование в диагностических целях иммунологические реакции организма, например серологический и аллергологические методы или серологическая идентификация микроорганизмов;

5) молекулярно-генетический метод основывается на обнаружении в биологическом материале молекул ДНК возбудителя. К ним относятся секвенирование генома, полимеразная цепная реакция (ПЦР), метод молекулярной гибридизации и др.

В объеме курса дисциплины микробиологии для биологических специальностей университета более подробно рассмотрен метод микроскопирования.

На современном этапе развития науки достигнуты большие успехи в области изучения морфологии микроорганизмов благодаря использованию электронного микроскопа, световой микроскоп также не утратил своего значения. Современный биологический микроскоп позволяет получить увеличение в 2000-2500 раз и легко установить ряд морфологических особенностей микроорганизма.

Наименьшее расстояние, при котором две соседние точки видны под микроскопом раздельно, называют его разрешающей способностью.

Увеличение разрешающей способности достигается двумя путями:

1) использованием объектива с большей числовой апертурой (выгравирована на каждом объективе). Наибольшей числовой апертурой обладают иммерсионные объективы (МИ-90 или ОИ-90), этими объективами пользуются при исследовании морфологии микроорганизмов;

2) уменьшением длины волны света, которым освещается препарат. В таком случае исследования проводят в ультрафиолетовом свете, длина волны которого меньше, чем в видимом свете. Для этого имеются специальные УФ-микроскопы. Наименьшие частицы, которые можно хорошо рассмотреть под световым микроскопом, должны по размерам быть больше ⅓ длины волны света. Это значит, что под современным световым микроскопом можно рассмотреть строение таких микроорганизмов, которые имеют величину не менее 0,2–0,3 мкм.

С помощью биологического микроскопа можно детально рассмотреть главным образом фиксированные и окрашенные микроорганизмы. В живом состоянии они прозрачны и плохо видны в проходящем свете. Для изучения микроорганизмов в живом виде применяют ряд дополнительных приборов к микроскопу [2].

Устройство микроскопа

Световой микроскоп – сложный оптический прибор, предназначенный для изучения в сильно увеличенном изображении мельчайших предметов, организмов и структур тканей, не видимых невооруженным глазом. Микроскоп называется световым, так как он обеспечивает возможность изучать объект в проходящем свете в светлом и темном поле зрения, проводить фазово-контрастную, люминесцентную и другие виды микроскопии. На рисунке 1 представлены устройство световых микроскопов Микмед - 1 и Биолам.

Основные элементы конструкции современных световых микроскопов – механическая и оптическая части.

В состав механической части входят подставка, коробка с микрометренным механизмом микрометренным винтом, тубус, тубусодержатель, винт грубой наводки, кронштейн конденсора, винт перемещения конденсора, револьвер и предметный столик.

Объективы, окуляры и осветительное устройство (конденсор с диафрагмой и светофильтром, зеркало или электроосветитель) относятся к оптической системе микроскопа.

Разновидности световой микроскопии: темнопольная, фазово-контрастная, ультрафиолетовая, люминесцентная. Электронная микроскопия.

Темнопольная микроскопия для этого вида микроскопии используют специальный конденсатор, пропускающий только краевые лучи источника света, направленные косо. Поле зрения оказывается темным, а освещаемый рассеянным светом объект – светлым.

При микроскопировании в темном поле на верхнюю поверхность конденсора наносят каплю иммерсионного масла и накладывают покровное стекло, с объектом стараясь, чтобы не образовались пузырьки воздуха. Затем на покровное стекло наносят каплю масла с целью достижения однородности среды для проходящих лучей с одинаковым коэффициентом преломления. Это позволяет более четко видеть объект.

 

 

А – МИКМЕД-1; Б – БИОЛАМ

1 – окуляр, 2 – тубус, 3 – тубусодержатель, 4 – винт грубой наводки, 5 – микрометренный винт, 6 – подставка, 7 – зеркало, 8 – конденсор, ирисовая диафрагма и светофильтр, 9 – предметный столик, 10 – револьверное устройство, 11 – объектив, 12 – корпус коллекторной линзы, 13 – патрон с лампой, 14 – источник электропитания

 

Рисунок 1 – Устройство световых микроскопов

 

Использование этого вида микроскопирования позволяет рассмотреть такие детали в строении микроорганизмов, совершенно не видные в проходящем свете.

Фазово-контрастная микроскопия позволяет видеть контрастное изображение живых микроорганизмов. Для этого вида микроскопии применяют специальное фазово-контрастное устройство, которое состоит из набора фазовых объективов, обозначенных «О». Этот метод основывается на том, что отдельные участки исследуемой клетки отличаются по показателю преломления, поэтому свет, проходящий через них, распространяется с разной скоростью, и это проявляется в различной яркости изображения отдельных участков. В результате всего этого изображение выглядит контрастным.

Люминесцентная микроскопия основана на том, что объект или вещество, освещается коротковолновым светом (ультрафиолетовым, синим), начинает светиться. Если объект сам содержит химические вещества способные флуоресцировать при освещении их коротковолновым светом, то такое явление называют первичной люминесценцией.

В этом виде микроскопии чаще используют явление вторичной люминесценции, когда свечение объекта происходит в результате обработки специальными красителями – флюорохромами. К ним относятся акридиновый желтый, акридиновый оранжевый, аурофосфин и др.

Люминесцентную микроскопию осуществляют с помощью обычного микроскопа с набором светофильтров и источником ультрафиолетового света. Набор светофильтров состоит из первого фильтра (синего) который пропускает длинноволновую часть спектра, его помещают перед источником света, второй фильтр помещают в окуляр микроскопа, и он пропускает только люминесцентное свечение исследуемого препарата. Чтобы приготовить препарат для этого вида микроскопирования каплю жидкости с микроорганизмами смешивают с каплей раствора красителя – флюорохрома и покрывают покровным стеклом

[2, с.14].

Электронная микроскопия применяется не только в биологии, но и в таких научных отраслях как физика, химия, минералогия. При этом виде микроскопирования изображение объекта на специальном флуоресцирующем экране получается с помощью потока электронов, а не луча света, как в световом микроскопе.

Электронные микроскопы в зависимости от назначения и способов наблюдения объектов делятся на просвечивающие, отражательные, эмиссионные, растровые, теневые и зеркальные. Электронный микроскоп, используемый в биологических исследованиях чаще просвечивающего типа.

 

 

Рисунок 2 – Электронный микроскоп

 

Разрешающая способность электронных микроскопов достигает 1–0,5 нм, с увеличением в 500–600 тыс. раз. Общий вид электронного микроскопа показан на рисунке 2.

Конструкция электронного микроскопа и схема построения объектов изображения объектов пучком проходящих электронов являются своеобразными копиями обычного светового микроскопа. Препараты для электронного микроскопирования готовят способом, кардинально отличающимся от способа, который используется при светооптической микроскопии.

Культуры микроорганизмов, ультратонкие срезы, другие объекты и ткани готовятся на очень тонкой (10–15 нм), проницаемой для электронов подложке. Для которой чаще используют тонкую пленку, изготавливаемую из коллодия, формвара, угля или кварца. Пленки из-за их тонкости и непрочности помещают на специальные медные сетки или бленды с мелкими ячейками[3].